質粒構建是指選定的目的外源基因（DNA）先要經(jīng)過PCR擴增。隨后用限制性內切酶分別切割載體和外源DNA片段，再使用DNA連接酶將切割后的載體與DNA片段連接，轉入宿主細胞。最后經(jīng)過篩選鑒定出正確的重組克隆質粒，實現(xiàn)目的基因在宿主細胞內的正確表達。那么質粒構建實驗影響因素有哪些呢？讓我們一起來看看吧！

一、載體的選擇

在選擇克隆載體時應注意以下幾點：

①具有自主復制能力，拷貝數(shù)高；

②攜帶易于篩選的選擇標記；

③含有多種限制酶的單一識別序列，以供外源基因插入；

④載體應盡可能?。ǎ?5kb），便于導入細胞和進行繁殖；

⑤使用安全?？寺≥d體應只存在于有限范圍的宿主內，在宿主體內不進行重組，不發(fā)生轉移，不產(chǎn)生有害性狀，并且不能離開工程宿主自由擴散。

二、引物設計注意事項

在構建質粒時，設計引物時應該考慮引物長度、引物的GC含量、引物的Tm值等因素，并避免引物間出現(xiàn)配對突變或二次結構等情況。

前向引物：5’端 -- 上游克隆載體末端同源序列 + 基因正向擴增引物 --3’端

反向引物：3’端 -- 基因反向擴增引物 + 下游克隆載體末端同源序列 --5’端

運用PCR擴增目的基因的過程中，引物設計注意事項：

① 引物長度最好在18-30bp左右，常用的長度是 20-22bp；

②引物 Tm 值最好在 60℃ 左右，兩條引物間 Tm 值要保持接近，相差最好不要超過 5°C；

③GC 的含量標準通常為 40%-60% 或45-55%；

④引物自身不應含有連續(xù)超過4個的互補的堿基，避免形成發(fā)卡結構或形成引物二聚體；

⑤引物的3’端要避免出現(xiàn)連續(xù)重復的堿基，如 GGG 或 CCC ，這會導致錯配的發(fā)生，最后一個堿基最好是 G 或 C；

⑥在引物的 5’端添加酶切位點時（在不影響擴增的特異性的前提下），根據(jù)酶切位點序列，需要添加不同種類和數(shù)量的保護堿基，通常多加3個堿基即可滿足保護酶切位點的需求；

⑦上下游引物最好加入不同的酶切位點，相同的酶切位點可能導致目的基因片段出現(xiàn)倒置連接現(xiàn)象，影響基因序列的正常表達。

三、酶切位點的選擇

選擇合適的剪切酶和連接酶對于質粒構建至關重要。剪切酶的選擇應該考慮酶切位點的位置、酶的反應條件等因素。連接酶的選擇應該根據(jù)所用的質粒載體和目的基因的大小來確定。

①選擇質粒上兩個酶切位點的距離不應小于太小（>10bp），否則影響限制性內切酶對切點的識別，不利于空載體的雙酶切。

②一般目的基因用于克隆表達的情況下，酶切位點的選擇要考慮到：

目的基因片段內部不含有所選的酶切位點（不然鑒定陽性重組子雙酶切時會將目的基因切斷）。

③實驗后繼應用的所有載體（真核、原核、酵母、昆蟲）都盡可能含有所選的酶切位點。并且要保證在載體上的插入方向正確（定向克隆）。（不然換載體表達時，還要重新設計引物，以引進新的酶切位點）。

④盡可能選比較常用的酶切位點（常用切點酶的價格比較便宜）。

⑤兩個酶切點至少隔上3個堿基。

⑥兩個酶切點最好不要是同尾酶（切下來的殘基不要互補），否則效果相當于單酶切。

⑦最好使用酶切效率高的酶。

⑧最好使用雙酶切有共同buffer的酶。

⑨在操作酶切連接的步驟時也要定性定量，保證酶活性充足。

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